Il protagonista di Resident Evil 4 è l'agente Leon Scott Kennedy, ex poliziotto scampato all'incidente di Raccoon City avvenuto sei anni prima (Resident Evil 2 e 3). Adesso Leon è un agente al servizio del Governo degli Stati Uniti d'America. Leon viene incaricato di ritrovare Ashley Graham, la figlia del presidente, rapita da soggetti sconosciuti e portata in un piccolo villaggio europeo (probabilmente in Spagna, anche se sussistono degli anacronismi). Leon ha quindi il compito di trovare Ashley e riportarla a casa, oltre che scoprire cosa è successo a un altro agente inviato a cercarla e poi scomparso.

Arrivato nello sperduto villaggio dove avrebbe dovuto trovarsi Ashley, Leon si imbatte negli abitanti del luogo, che per qualche ragione si rivelano essere estremamente ostili. Nel corso delle ricerche, Leon scoprirà poi che sono loro i responsabili della morte dell'agente scomparso. Tutti gli abitanti del luogo sono infatti membri di una setta religiosa di fanatici che si fanno chiamare Los Illuminados (gli illuminati). A capo di questa setta è un certo Lord Hosmund Saddler, che si rivela essere anche responsabile del rapimento di Ashley, apparentemente a scopo di riscatto. Leon ritroverà Ashley, e incontrerà poi anche un certo Luis Sera, apparentemente un ricercatore, che lo aiuterà fornendogli delle informazioni su quanto stava realmente accadendo in quel luogo.

Nel villaggio erano stati effettuati dei normali scavi di miniera, e in uno di questi erano state ritrovate delle "spore" che, come un virus, avevano infettato i minatori che le avevano inalate. Conducendo su queste spore delle ricerche (a cui anche Luis sembrava aver partecipato) si era scoperto che erano in realtà degli ovuli disseccati di un organismo parassita da lungo estinto, almeno apparentemente, che si erano poi risvegliati e schiusi nei corpi dei minatori che li avevano ingeriti incidentalmente. questi parassiti vennero ribattezzati Las Plagas (le piaghe). I parassiti erano in grado di infestare a lungo un corpo ospite, modificandone il comportamento secondo necessità, mentre le Plagas crescevano, si sviluppavano nel corpo infestato fino a trasformarlo in un vero e proprio mostro. Lord Saddler aveva sfruttato queste proprietà delle Plagas, infettando con le spore se stesso e tutti gli abitanti del luogo, creando la setta degli Illuminados, mentre i poteri delle Plagas gli consentivano di esercitare un controllo totale su tutti i soggetti infestati. In questo episodio troveremo anche Ada Wong, già incontrata in Resident Evil 2. A questo punto Lord Saddler aveva formulato un piano per rapire la figlia del presidente con l'apparente scopo di ottenere un riscatto, ma che in realtà sarebbe servito a diffondere l'infezione, in quanto Ashley era stata di proposito infettata con un ovulo, in modo che, una volta tornata in patria, avrebbe diffuso l'infestazione. Anche Leon era stato infettato dalle plagas di modo che, una volta totalmente assoggettato alla volontà di Saddler, non sarebbe più stato d'intralcio ai piani degli Illuminados.

Il nuovo gameplay di Resident Evil è più simile a quello di uno sparatutto in terza persona che a quello di un tradizionale survival horror. A causa della scomparsa degli zombie, questo capitolo è considerato come una svolta definitiva della serie. I nemici sono decisamente più veloci e intelligenti degli zombie presenti nei titoli precedenti. Questi nuovi nemici corrono, schivano attacchi fisici e proiettili. Una volta erano semplici contadini, questi Ganados sono il prodotto dell’infestazione delle plagas, i parassiti riportati in vita dalla famiglia Salazar per ripagare il debito alla religione associata con gli Illuminados.

Resident Evil 4 contiene anche cambiamenti nell’inventario, nella telecamera, e nel sistema del controllo dei movimenti. La prospettiva di visuale è al di sopra della spalla del protagonista, molto simile a quella di Tom Clancy's Splinter Cell. Normalmente, la telecamera rimane dietro al personaggio, che rimane visibile. Il gioco vanta pure una presentazione più elaborata usando il letterbox, come nel videogame Beyond Good & Evil. Anche se i controlli sono più o meno gli stessi dei capitoli precedenti, in Resident evil 4 non c'è più il blocco automatico degli obiettivi, e si mira manualmente.

Il coltello da combattimento non è più presente nell’inventario del giocatore, ma può essere estratto in qualunque momento,con l'apposito tasto. Il coltello ora funziona sia come strumento e sia come arma, ed è molto più potente che nei giochi precedenti: Può rompere vetri ed oggetti specifici, come casse e barili (che spesso contengono oggetti importanti, ma a volte anche serpenti). Come arma, è molto utile per dare il colpo di grazia ai Ganados che sono feriti a terra, ed al contrario degli zombie dei giochi precedenti, i Ganados non cercano di attaccare le gambe del protagonista una volta a terra.

Un altro nuovo aspetto di Resident Evil 4 è l’inclusione dei controlli context-sensitive. Il giocatore può, in base alla situazione, interagire con specifici aspetti dell’ambiente, come scendere una scala, saltare fuori da una finestra, o schivare un’attacco nemico. Il giocatore può compiere un'attacco fisico contro un Ganado (come con altri nemici) mentre il nemico è abbassato o stordito. Ci sono pure intermezzi dinamici simili ai Quick Time Events di Shenmue, nei quali il giocatore deve premere ripetutamente un tasto indicato su schermo per eserguire azioni come schivare un masso in caduta o colpire il nemico. Questa tecnica è a volte impiegata nei combattimenti coi boss per dare al giocatore la possibilità di dare il colpo di grazia.

I tempi di caricamento sono ridotti al minimo, diversamente ai Resident Evil precedenti, dove gli spostamenti tra un’area e un’altra richiedono una schermata di caricamento (in Resident Evil Zero per GameCube, queste schermate di caricamento sono state inserite per rendere omaggio ai Resident Evil originali. In Resident Evil 4, i caricamenti tra un’area a un’altra sono descritti con una scritta in basso a destra. Un area può caratterizzare enormi edifici e una enorme base militare. Le porte si aprono premendo il tasto azione nelle vicinanze.